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TRV2GO

Ziel

Die viröse Eisenfleckigkeit der Kartoffel, hervorgerufen durch das Tobacco rattle virus, wird zunehmend zu einem Problem. Die resultierenden Knollenmängel führen zu Annahmeweigerung ganzer Partien. Da das Virus aber nicht nur zu sichtbaren Qualitätsmängeln der Knolle führt, sondern sortenabhängig eine Verzögerung des Auflaufens der Pflanzen sowie Ertragseinbußen bis zu 62 % bewirkt, ist der tatsächlich verursachte Schaden deutlich höher.

Da keine Resistenzen bekannt sind, ist die frühe und sichere Diagnose infizierter Kartoffelpflanzen ein essentieller Baustein bei der Bekämpfung des Virus.

Derzeit sind zwei Nachweisverfahren zur Diagnose von TRV in Kartoffeln etabliert:

  1. ELISA mittels Antiseren welche das Hüllprotein des Virus erkennen, wobei dieser Test das Virus nicht umfassend nachweisen kann, da es auch zu Hüllprotein-freien Infektionen kommt (NM-Typ).
  2. Nachweis der RNA1 des Virus in der Knolle mittels RT-PCR. Die RNA Isolierung aus Knollen ist anspruchsvoll da die Stärkemoleküle den Aufreinigungsprozess stören. Zudem setzt diese Technik eine gute labortechnische Ausstattung mit modernen Analysegeräten voraus.

Ziel des Projekts TRV2GO war daher die Entwicklung eines einfachen, stabilen, sensitiven, ohne spezielle Ausstattung durchführbaren und somit praxistauglichen Diagnoseverfahrens für das Tobacco Rattle Virus (TRV) in Kartoffeln.

Dazu sollten verschiedene Methoden zum Einsatz kommen. Zunächst sollten polyklonale Anti-Transportprotein (TP)-Seren produziert werden, da das Transport Protein im Gegensatz zum Hüllprotein von der viralen TRV-RNA1 kodiert wird und somit auch in NM-Typ Infektionen vorhanden ist. Im Anschluss sollten diese Antiseren zur Entwicklung eines tragbaren Schnelltests verwendet werden. Parallel sollte versucht werden einen alternativen Nachweis der viralen RNA1 zu entwickeln, der sensitiv aber unabhängig von umfangreicher Laborausstattung ist. Daher sollte der Nachweis auf Basis einer isothermalen Amplifikation erfolgen.

Ergebnisse

Zur Produktion der Anti TP Seren wurden zunächst die relevanten Virusisolate identifiziert und partiell sequenziert. Die erhaltenen Sequenzinformationen zeigten, dass im Falle des TP die Aminosäuresequenz konserviert war. Außerdem dient der umfangreiche Sequenzvergleich zur Ableitung neuer Primer für die isothermale Amplifikation.

Nach Expression des TP in E. coli wurde das Antigen zur Herstellung polyklonaler Anti-TP-Seren verwendet. Außerdem wurden aus dem TP und dem 16 kDa Protein je zwei Epitope selektiert und zur Produktion von Peptidantikörpern verwendet.

Nach ausführlicher Testung der Antiseren zeigte sich, dass diese zwar das Antigen spezifisch erkennen, jedoch keines der Antiseren die nötige Sensitivität besitzt um TRV Infektionen in Knollenmaterial weder im Western Blot, noch im ELISA Experiment zuverlässig nachzuweisen.

Für die Entwicklung eines Nukleinsäure-basierten TRV Nachweises wurden verschiedene Methoden der isothermalen Amplifikation getestet (RPA, Cas9 nickase-based amplification reaction, LAMP). RPA und der LAMP lieferten vielversprechende Ergebnisse. Da die RPA jedoch einen ähnlich hohen präparativen Aufwand wie die RT-PCR erfordert, wurde im Folgenden der Fokus auf die LAMP gelegt und diese für die TRV Detektion weiter optimiert. Da es möglich ist relativ einfache Knollenextrakte als Template einzusetzen und da der Erfolg der Reaktion spezifisch mittels Dipsticks nachgewiesen werden kann, ist es nun möglich die TRV RNA1 schnell und ohne besondere apparative Laborausstattung nachzuweisen.

Verwertung

Mit Hilfe der neuen TRV Diagnosetechnik ist eine Untersuchung von Knollen und damit eine Unterscheidung viröser von physiologischer Eisenfleckigkeit direkt möglich. Die Testmethode ermöglicht die Überwachung und Qualitätssicherung der Knollenproduktion bezüglich viröser Eisenfleckigkeit und damit eine Identifikation TRV-belasteter Flächen nicht nur wie bisher im Labor und mit aufwändiger Ausrüstung, sondern u. U. direkt vor Ort und mit einer deutlichen Reduktion und Verbrauchsmitteln. Damit fügt sie sich in das bestehende Qualitätsmanagment ein und ersetzt die aufwändige RT-PCR-Analytik.

Broschüre: Präsentation TRV2GO
Dokumenttyp: PDF Dokumentgröße: 580 KB

Broschüre Beschreibung:

Entwicklung eines praxistauglichen Diagnoseverfahrens für Tobacco rattle virus in Kartoffel